Heidelberg – Forscherinnen und Forscher des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL) in Heidelberg haben erstmals den Aufbau von Ribosomen in intakten menschlichen Zellen sichtbar gemacht. Wie das EMBL Heidelberg mitteilte, gelang das mit einer Kombination aus Kryo-Elektronentomografie (Kryo-ET) und korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM). Die Ergebnisse erschienen in der Fachzeitschrift Science.
Ribosomen sind molekulare Maschinen, mit denen Zellen Proteine herstellen. Ihr eigener Zusammenbau ist aufwendig. Viele der zugrunde liegenden Mechanismen kannte man bisher aus Untersuchungen außerhalb der Zelle (ex situ). Wie der Aufbau in der Zelle selbst abläuft (in situ), war bislang kaum erforscht.
Zusammenarbeit dreier Arbeitsgruppen
Die Studie entstand in einer Kooperation der Arbeitsgruppen von Christoph Müller, Sara Cuylen-Häring und Julia Mahamid am EMBL Heidelberg. Sie untersuchten den Nukleolus, also den Ort in der Zelle, an dem Ribosomen zusammengebaut werden. Die Auflösung reichte aus, um den Weg der Ribosomenbildung in intakten menschlichen Zellen zu verfolgen. Die Bilder zeigen Zwischenstufen dieses Wegs als Strukturen im Subnanometerbereich. Sie ergänzen und erweitern, was man aus Strukturen außerhalb der Zelle wusste.
Warum die gewohnten Methoden nicht reichten
Frühere Studien zu Prä-Ribosomen, den strukturellen Vorstufen der Ribosomen, setzten Verfahren ein, bei denen die Bauteile aus der Zelle herausgelöst werden mussten. Dabei lösten sich teils Komponenten voneinander, die sich nur vorübergehend aneinander binden. In der Zelle selbst ist der Nukleolus schwer zu untersuchen: Er ist ein extrem dichtes Kompartiment im Zellkern mit geringem Kontrast, das sich mit Kryo-ET nur mühsam darstellen lässt.
Deshalb koppelte das Team Kryo-ET mit Kryo-CLEM. Erstautor Xiaohan Zhao, Predoctoral Fellow in Müllers Gruppe, sagte, die Kombination habe sehr geholfen zu erkennen, wo der Prozess tatsächlich stattfindet. Die Prä-Ribosomen ließen sich so nicht nach dem Herauslösen, sondern direkt in den Nukleoli beobachten.
Beide Techniken gelten als etabliert. Julia Mahamids Gruppe zählt bei der Entwicklung der Kryo-ET zur Spitze, Kryo-CLEM nutzen viele Forschende am EMBL. Ganze menschliche Zellen sind zu dick für die Elektronenmikroskopie. Sie werden deshalb schockgefroren und in dünne Scheiben geschnitten. Daraus entstehen Bilder, die Tomogramme heißen. Mehrere Tomogramme lassen sich zu dreidimensionalen Aufnahmen kleiner Zellbereiche zusammensetzen.
Eine weitere Hürde war der winzige Nukleolus in der großen Zelle. Das Team markierte die interessierenden Bestandteile und lokalisierte sie mit Fluoreszenzmikroskopie. Christoph Müller erklärte, unter dem Elektronenmikroskop sei im Grunde alles grau. CLEM lasse die markierten Bestandteile aufleuchten, sodass das Team gezielt hochaufgelöste Tomogramme genau dieser Stelle aufnehmen konnte.
Um beide Bildarten übereinanderzulegen, brauchte es Orientierungspunkte, die in beiden Verfahren sichtbar sind. Lipidtröpfchen, kleine fettspeichernde Organellen, eigneten sich dafür. Die dünnen Scheiben enthielten jedoch zu wenige davon. Nach einem Gespräch mit einem Kollegen bei einem Kaffee kam Zhao auf die Idee, die Zellen mit etwas Ölsäure zu füttern. Das regte die Bildung genügend vieler Lipidtröpfchen an.
Ein Proteinfaktor bindet viel früher als gedacht
Der Aufwand habe sich gelohnt, sagte Müller. Das Team habe in menschlichen Nukleoli Dinge gesehen, die zuvor noch nie zu sehen waren. Dazu gehört ein Proteinfaktor, von dem man lange annahm, er binde erst spät im Prozess und helfe dann, eine fast fertige Ribosomenuntereinheit aus dem Zellkern zu exportieren. Nach Zhaos Angaben bindet er tatsächlich viel früher. Das liefere wichtige Einblicke in die räumliche und zeitliche Abfolge der Vorgänge beim Aufbau.
Die Karten stützen sich auf mehr als 300 Tomogramme. Damit konnte das Team Mechanismen der Untereinheiten-Bildung, die bisher nur außerhalb der Zelle bekannt waren, in intakten Zellen bestätigen. Außerdem fanden die Forschenden weitere wichtige Interaktionspartner. Rekonstruiert wurden zwei zentrale Vorstufen der Untereinheiten, der SSU-Processome und das Prä-60S, mit Auflösungen im Subnanometerbereich. Atomare Auflösung sei das nicht, sagte Zhao, aber sie reiche aus, um Sekundärstrukturelemente von Proteinen und RNA zu erkennen.
Eingriff in die Regulation
Das Team untersuchte auch, wie der Aufbauweg reguliert wird. Dazu blockierte es die RNA-Polymerase I, die zu Beginn des Prozesses die ribosomale RNA herstellt. Cuylen-Häring sagte, ihre Gruppe erforsche den Nukleolus seit Jahren mit Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen nach einer solchen Hemmung. Wie sich dabei die räumliche Organisation des Ribosomenaufbaus entwickelt, sei ihr aber unbekannt gewesen. Es sei unglaublich gewesen, diese Veränderungen endlich im molekularen Detail zu sehen.
Binnen einer Stunde nach der Blockade hatte sich die Zusammensetzung der entstehenden Partikel deutlich verändert, und eine Vorstufe einer Untereinheit war aus dem Nukleolus verschwunden. Zhao nannte als mögliche Erklärung, dass die eine Untereinheit rasch hinausgelangte, während die andere im Inneren festsaß. Beide Untereinheiten folgen zudem unterschiedlichen Kinetiken: Der Aufbau der kleinen Untereinheit läuft schneller und dauert unter einer Stunde, die große braucht länger. Das könnte nach Zhaos Worten auf unterschiedliche Regulationsmechanismen hindeuten.
Keine lineare Fließbandfertigung
Außerdem prüfte das Team eine lang gehegte Annahme. Dafür konnte es jede Struktur ihrer Position in der Zelle zuordnen. Man hatte gedacht, Ribosomen reiften stetig, während sie vom Zentrum des Nukleolus zu seinem Rand wandern, sagte Müller. Bei genauerem Hinsehen ließ sich Reife aber nicht sauber einem Ort zuordnen. Eine mögliche Erklärung seien mehrere Zentren, deren Gradienten sich überlagern und vermischen.
Ausblick
Die Sammlung von Momentaufnahmen ähnelt allmählich einem Film vom Aufbau der Prä-Ribosomen, ist aber noch keiner. Die Studie legt nach Angaben des EMBL eine konzeptionelle Grundlage für weitere Arbeiten. Müller wies darauf hin, dass die frühesten Zwischenstufen noch zu klein sind, um sie aufzulösen. Die Größe bleibe eine generelle Grenze der Kryo-ET in Zellen. Mit mehr Daten könnten die Bilder aber eine dynamischere Geschichte erzählen. Zhao nannte als weiteres Forschungsthema, wie die Partikel aus dem Nukleolus und aus dem Zellkern hinaustransportiert werden. Mit demselben Ansatz ließen sich womöglich auch andere große Komplexe im Zellkern untersuchen.
Müller geht davon aus, dass die Methode weit über Prä-Ribosomen hinaus an Bedeutung gewinnt, weil man ein zelluläres Ereignis gezielt anpeilen, komplexe Prozesse verstehen und scharfe Bilder des gesamten Ablaufs erhalten könne. Die Studie zeige, dass Ribosomen nicht an einem festen Fließband entstehen, sondern in einem lebendigen, dichten Raum, in dem Ort und Zellbedingungen mitbestimmen, wie der Aufbau verläuft.
Gesamtbild
Im Nukleolus verbinden sich ribosomale RNA und Ribosomenproteine zu den beiden Untereinheiten des fertigen Ribosoms. Laut Wikipedia entstehen dabei die kleine 40S- und die große 60S-Untereinheit.
Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) bestimmt laut EMBL die Form gefrorener Proben, indem Elektronen auf sie gefeuert und die entstehenden Bilder aufgezeichnet werden. Die Kryo-ET ist eine Weiterentwicklung. Während die Kryo-EM hochgereinigte Moleküle untersucht, erlaubt die Kryo-ET nach Angaben des EMBL 3D-Momentaufnahmen molekularer Wechselwirkungen in der Zelle.
Die Grundlage dafür wurde am EMBL in Heidelberg gelegt. Dort entdeckten laut EMBL Gruppenleiter Jacques Dubochet und Techniker Alasdair McDowall, dass sich Proteine durch Schockgefrieren in flüssigem Ethan festhalten und in ihrer Struktur erhalten lassen. Der Vorgang heißt Vitrifizierung.
Bewertung
Reizvoll an der Studie ist, dass sie ein lange gepflegtes Bild vom Fließband im Nukleolus infrage stellt. Das Ergebnis liest sich vorsichtig, denn die Forschenden nennen die Erklärung mit mehreren Zentren selbst nur eine Möglichkeit. Offen bleibt, wie belastbar die Beobachtungen über Zelltypen hinaus sind. Für Laien ist der Nutzen vorerst Grundlagenwissen, konkrete Anwendungen nennt die Mitteilung nicht.
